일반생물학 및 실험 (1) 세균의 세포호흡에 의한 메틸렌 블루 용액의 환원 및 탈색 관찰 실험 보고서

실험제목 및 날짜

 

본 보고서는 2023년 5월 19일 일반생물학(1) 실험 수업 중 ‘세균의 세포호흡에 의한 메틸렌 블루 용액의 환원 및 탈색 관찰 실험’ 에 대한 보고서입니다

 

서론

 

생물권에 존재하는 모든 개체들은 그들만의 다양한 물질대사 방법으로 에너지를 생산하여 생명활동을 이어나가고 있습니다. 생물체들이 사용하는 여러 형태의 에너지원의 근본은 태양에너지입니다. 즉, 지구상에 있는 거의 모든 생물들은 태양에너지에 직접적 또는 간접적으로 의존하고 있습니다. 이중 직접적으로 태양에너지를 화학에너지로 바꾸어 사용하는 광독립생물들은 식물, 조류, 광합성세균, 일부 다세포 진핵생물 등이 있습니다. 이러한 물질대사를 광합성이라고 하는데, 광합성은 빛의 에너지를 이용하여 ATP와 NADPH 와 같은 화학에너지를 만들고 여러 가지 고분자 물질, 유기물 등을 합성합니다. 유기물을 직접적으로 생산할 수 없는 생물들은 광합성을 하는 유기체를 먹어서 유기물을 얻습니다. 이러한 생물들을 종속영양생물이라고 합니다.

 

세포호흡은 광합성과 반대의 물질대사로 탄소가 포함된 유기물을 분해하여 에너지를 얻는 화학반응을 말합니다. 이러한 세포호흡을 통해 생명활동 지속에 필요한 ATP가 생성됩니다. 세포호흡은 산소가 필요한 호기성호흡과, 산소가 사용되지 않는 혐기성 호흡으로 나누어집니다. 이때, 알콜발효와 젖산발효는 혐기성 호흡의 일종입니다.

 

 

세포호흡에 있어서 최종전자수용체의 존재는 매우 중요합니다. 호기성 호흡에는 산소가 최종전자수용체로 사용되는데 산소가 없다면 세포호흡은 중단되게 되며 시간이 경과하면 세포가 죽어버리게 됩니다. 혐기성 호흡은 산소대신 이산화탄소, 황산염이온, 질산염 이온, 황, 등이 최종전자수용체로 사용됩니다. 이때 전자가 전자전달복합체를 거치며 산화-환원 반응이 연속적으로 발생하며 전자가 가지고 있는 에너지가 방출되어 ATP가 만들어지는데 이러한 ATP 생성을 산화적 인산화라고 합니다.

 

세포호흡은 크게 4가지 단계를 거쳐서 진행됩니다. 해당-피루브산 산화- 크랩스 회로- 전자전달계 및 화학삼투의 순서를 거쳐서 세포호흡이 진행되고 최종전자수용체로 전자가 나오게 됩니다.

 

 

해당과정은 세포질에서 일어나며 산소의 유무가 영향을 미치지 않습니다. 1개의 포도당 분자가 분해되기 위해서는 우선 2개의 ATP가 투입됩니다. 이후 포도당이 일련의 과정을 거쳐서 2개의 G3P 로 바뀌게 되는데 1개의 G3P는 2개의 ATP와 1개의 NADPH를 내놓으며 피루브산으로 바뀌게 됩니다.

 

해당과정을 거친 후 생성된 피루브산은 극성을 띠기 때문에 능동수송을 통해 미토콘드리아의 외막, 막사이공간, 내막을 통과하여 미토콘드리아 기질로 들어옵니다. 이때 산소가 있어야 미토콘드리아 기질로 피루브산이 들어올 수 있습니다. 이후 피루브산 산화, TCA 회로, 전자전달계 및 화학삼투를 통해 탄소는 이산화탄소로 분해되어 배출되고, 전자는 수소, 산소와 결합하여 물이 만들어지게 됩니다.

 

발효, fementation는 산소가 없는 환경에서 해당과정만으로 ATP를 생성하기 위해 조효소 NAD 플러스가 만들어지는 과정으로 요약할 수 있습니다. 해당과정으로 만들어진 피루브산이 산소가 없어 미토콘드리아 기질로 들어가지 못하고 효모 또는 젖산균에 의해 NAD플러스를 만들고 부산물로 다른 물질을 생성합니다. 발효의 예로는 알콜발효 , 젖산발효가 있습니다.

실험목적

세균 배양액 속 세균들의 세포호흡을 통한 메틸렌 용액의 환원 및 탈색 과정을 관찰 및 이해하고 다양한 조건과 환경을 설정하여 세포호흡에 영향을 미치는 요인들을 분석하기 위해서 입니다.

 

 

discussion

 

실험결과분석

 

• 각각의 시험관 속에 들어있는 액체의 부피는 일정합니다.

 

• 메틸렌블루 용액은 산화되면 푸른 빛을 띠고 환원되면 무색을 띱니다. 전자를 잃었을 때, 수소원자를 잃었을 때, 그리고 산소를 얻었을 때 산화되었다고 표현합니다. 본 실험에서 메틸렌 블루 용액의 탈색을 관찰하는 것은 용액이 산소를 잃어 환원되는 것을 의미합니다.

 

• 각각의 용액에는 숙신산이 들어가 있습니다. 호기성 호흡과정에서 포도당이 해당과정을 거쳐 2 개의 피루브산이 되고 피루브산 산화를 거쳐 아세틸 CoA가 됩니다. 이 아세틸 CoA는 TCA회로로 들어가게 되는데 TCA 회로를 들어간 아세틸 CoA는 시트르산, 알파-케틸글루타르산, 숙신산, 말산, 옥살산을 거쳐 회로를 1바퀴 돌게 됩니다. 따라서 시험관 속 숙신산은 세균이 세포호흡할 때 사용하는 유기물질, 즉 포도당의 일종으로 해석할 수 있습니다.

 

모든 시험관은 뚜껑이 닫혀진 상태로 실험 및 관찰이 진행되었습니다. 따라서 시험관 속에서 일어난 세포호흡은 무산소 호흡의 일종인 발효의 과정으로 해석하였습니다. 또한 실험에 사용된 세균은 Pseudomonas aeruginosa 로 원핵생물의 일종입니다. 원핵생물은 미토콘드리아가 없기 때문에 산소가 공급되지 않을 경우 세포질에서 발효의 과정이 일어나게 되어 기질수준 인산화를 통해 ATP를 만들게 됩니다.

 

A시험관: A 시험관은 숙신산(포도당)이 들어가지 않았기 때문에 세포호흡이 일어나지 않을 것이라고 예상했지만 어떠한 이유로 인해 산소가 소비되어 메틸렌 블루 용액이 환원되어 탈색이 관찰되었습니다. 이것은 두가지 원인을 예상하였는데 첫 번째로 실험자의 실수로 숙신산이 시험관에 적정되어 세포호흡이 진행되어 산소가 소모되었을 것입니다. 두 번째로 세균현탁액 속에 들어있는 유기물질이 세포호흡을 통해 분해되어 산소가 소모되었을 것입니다.

 

B시험관: B 시험관은 세균 현탁액이 들어가지 않았습니다. 따라서 세포호흡이 일어나지 않아 메틸렌 블루 용액의 환원이 일어나지 않았습니다. 메틸렌 블루 용액이 산소를 잃으면 환원되어 색이 투명해지는데 세포호흡이 일어나지 않기 때문에 메틸렌 블루 용액의 색깔에는 변화가 없습니다.

 

C, D, E, F시험관: C, D, E, F 시험관은 각각 C를 기준으로 세균 현탁액을 2배씩 증가시켰습니다. 그 결과, 세균의 양과 세포호흡으로 인한 시험관 내 산소의 소모는 비례한다는 결과를 관찰할 수 있었습니다.

 

G 시험관은 F 시험관과 동일한 조건의 시험관 내 환경을 조성하였습니다. 하지만, 시험관을 얼음통에 넣어두어 온도가 세포호흡에 미치는 영향에 대한 관계를 관찰하였습니다. 실험을 진행한 결과, 온도와 세균의 세포호흡 정도는 정비례한다고 판단하였습니다. 즉, 온도가 높을수록 세포호흡이 더 활발히 일어난다고 판단하였습니다. 이는 세균 자체의 온도에 따른 운동성 감소 특성에 따른 결과라고 예상하였습니다.

 

실험 재료 및 실험기구

 

아이스박스, 얼음, flask 500ml, 영양분 broth, 알콜램프, 루프, shaking 인큐베이터 (30도씨), cetrifugal tube(100ml), glass stick, 시험관, 스테인리스 스틸 시험관 거치대, 항온수조 (30도씨), pipet, name pen, 원심분리기, Pseudomonas aeruginosa 배양액, 메틸렌블루 용액, DW, 나트륨 phosphate 완충액, 숙신산

 

세부 실험 진행 과정

 

1. 7개의 시험관에 각각 A~G까지 글자를 주기합니다.

 

2. 각각의 시험관을 얼음통 속에 넣어둡니다.

 

3. 각각의 시험관에 메틸렌 블루 용액, 증류수 ,숙신산 용액을 지시된 용량만큼 적정합니다. 이때 신속히 용액을 적정한 후 뚜껑을 닫아 시험관의 오염을 최소화해야 합니다. 또한 시험관을 잘 흔들어 주어야 합니다.

 

4. A~F 까지 시험관은 섭씨 37도 수조에 넣고 G 시험관은 얼음 속에 넣어 둡니다.

 

5. 각 시험관 속에 적정되어 있는 메틸렌 블루 용액이 탈색되는 시간을 측정합니다.

 

Further study

 

1. 인체에서 발생하는 산소성호흡과 무산소성 호흡에 대하여 서술하시오.

 

• 인간은 기본적으로 산소성호흡을 하며 생명활동을 하는 생물입니다. 산소를 최종 전자수용체로 사용하여 ATP를 생성하여 필요한 에너지를 만들어 지속적으로 생명활동을 수행합니다. 앞서 서론에서 서술했듯이 체내에 들어온 포도당은 해당과정, 피루브산 산화, TCA회로, 전자전달계를 거치며, NAD플러스, FAD플러스 등을 내며 최종적으로 ATP를 생성하게 됩니다. 산소가 존재하는 일반적인 경우, 인간은 산소성호흡을 진행합니다. 산소성 호흡은 인간의 생명활동에 필수적이며 산소가 없다면 인간은 생명을 몇분이상 유지할 수 없습니다.

 

• 무산소성 호흡은 인체의 근육세포에서 관찰됩니다. 단거리 달리기와 같은 격렬한 운동을 하게 되면 근육세포에 존재하는 글리코젠이 분해되어 소모되게 됩니다. 글리코젠은 탄수화물의 일종으로 동물세포의 저장형 에너지와 같은 물질입니다. 이때 세포호흡 과정에서 산소가 적절히 공급되지 못해서 무산소성 호흡, 그 중 발효가 발생하게 됩니다. 발효의 과정을 요약하면 포도당이 분해되어 두 개의 피루브산이 되었을 때 산소가 없으면 미토콘드리아로 능동수송되어 산소성 세포호흡을 못하게 됩니다. 그 대신에 기질에서 젖산균에 의해 NAD플러스가 생성되어 해당과정에서 기질수준의 인산화를 통한 ATP생성을 계속 유지하게 됩니다. 이때 젖산이라는 부산물이 만들어져 체내에 쌓이게 되고 이러한 부산물(노폐물)은 인체에 피로와 통증을 유발하게 됩니다. 부산물들은 시간이 지나면 분해되어 체외로 배출됩니다. 인체에서 무산소성 호흡이 가능한 이유는 인체 내에 젖산 분해 효소가 들어있기 때문입니다.

 

2. 미생물 E.coli에서 발생하는 비산소성, 산소성 세포호흡 주기에 대하여 서술하시오.

 

• 대장균은 산소성 호흡과 비산소성 호흡의 두가지 호흡이 모두 가능한 미생물입니다.

 

• 먼저 산소성 호흡을 보게 되면 사람과 유사한 호흡과정을 거치게 됩니다. 포도당을 2개의 피루브산으로 분해한 후 피루브산 산화를 통한 acetyl CoA를 만듭니다. 이후 TCA 회로를 거쳐, 아세틸 CoA와 옥살산이 합쳐진 후, 시트르산, iso 시트르산, 2-oxoglutarate, 숙신산, fumarate, 말산, 옥살산을 거쳐 다시 회로를 돌게 됩니다. 비산소성 호흡의 경우 산소가 부족한 환경에서 ATP를 생성하기 위해 해당과정만이 반복되는 젖산 발효가 대장균 내에서 일어납니다. 젖산 발효로 인한 ATP 의 생성은 기질수준 인산화로 분류됩니다. 대장균과 같이 산소가 풍부한 환경에서 산소성 호흡을 하고 산소가 부족한 환경에서 무산소성 호흡을 하는 세균을 조건무산소성균 (facultative anaerobes)라고 합니다.

 

Reference

• Wasserman, S. A., Minorsky, P. V., Reece, J. B., & Campbell, N. A. Campbell biology. Eleventh edition. New York, NY, Pearson Education, Inc.; 2021. P 155