[SPARK 5기 1차 1조] Analysis of “AXL and Error-Prone DNA Replication Confer Drug Resistance and Offer Strategies to Treat EGFR-MutantLung Cancer (Ashish Noronha et al.)Established ”

 

intro

박테리아에게 항생제를 투여하면 SOS 반응이 활성화되어 항생제에 대한 저항을 가진 돌연변이가 나타나 치료에 제약이 있습니다. 이와 비슷하게 EGFR-돌연변이 폐암 치료를 위해 kinase inhibitor(TKI)를 투여하면 SOS반응과 비슷한 반응이 일어나 약물에 내성을 가진 세포가 나타나 치료에 제약이 있습니다. 본 논문에서는 GAS6의 수용체인 AXL의 발현을 낮추어 TKI약물에 대한 저항성을 감소시키는 것을 확인하였으며, 연구를 바탕으로 약물저항을 낮추는 새로운 치료전략을 제시하였습니다. AXL의 과발현은 저항을 가진 돌연변이 출현에 직접적인 영향을 끼칩니다. AXL의 과발현은 DTP세포의 생존률을 높이며, EGFR돌연변이인 T790M을 증가시킵니다. 한편, AXL은 DNA polymerase의 fidelity를 낮추며 MYC를 활성화시켜 퓨린합성을 증가시킵니다. 퓨린이 증가되면 피리미딘과의 불균형이 발생하여 돌연변이가 증가하게 됩니다. 따라서 AXL의 발현을 낮추면 저항 돌연변이의 발생을 줄일 수 있습니다.

 

figure1 설명-------------------------------------------------------------

 

먼저, Figure 1의 내용은 AXL의 활성화에 의해 cycling persister cell과 Residual disease(RD) patient의 경우 Gas6가 높게 발현되며, 이는 EGFR-mutant가 resistance를 가진다는 결과를 나타내고 있습니다. Figure 1B와 1C의 실험은 EGFR mutant lung cancer에서 유래된 single-cell subclone에 해당되는 PC9 cell을 Tyrosine kinase inhibitor(TKI)인 osimertinib에 노출시켜 진행되었습니다. Figure1B는 DTP(Drug-tolerant Persister) cell과 GAS6 발현의 연관성을 나타낸 결과로, GAS6는 상대적으로 noncycling persister에 비해 cycling persister에서 높은 발현을 보인다는 것을 알 수 있었습니다. 또한, Figure 1C는 TN(Treatment native) patient나 progressive disease(PD) patient에 비해 Residual Disease(RD) patient group의 대다수가 높은 GAS6의 발현을 보임을 확인할 수 있었습니다. 이 결과는 실질적으로 cognate RTK(Receptor Tyrosine Kinase)나 다른 RTK와 GAS6 간의 상호작용으로 persister cell의 proliferation이 가능함을 나타내는 것입니다. - 다음으로, Figure 1E와 1F의 실험을 살펴보면, Figure E는 TKI인 Erlontinib(에로티닙) and Osimertinib(오시머니팁)을 각각 처리한 AXL 과발현(OX) PC9 cells의 2개 clones이 control cell인 empty vector(EV)보다 수치가 증가함을 보여줍니다. 해당 실험 결과를 통해 AXL overexpression(OX) cell에 TKI를 처리했을 때 살아남은 persister(DTP) cell의 양이 많아졌다는 것을 알 수 있습니다. 또한, Figure F는 각각 TKI로 처리한 AXL Knock out(KO) PC9 cells의 2개 clones이 control cell인 guide RNA cell(PC9-WT)보다 persister cell의 수치가 감소하였음을 보여줍니다. 해당 결과로는 AXL knockout(KO) cell에 TKI를 처리했을 때 살아남은 persister(DTP) cell의 양은 더 적었다는 것을 알 수 있습니다. 이를 통해 TKI 처리 시 AXL overexpression(OX) cell에서 살아남은 persister(DTP) cell 수가 증가하고 lung cancer cell의 resistance가 유발되는 결과를 나타내게 됩니다. - Figure 1I와 Figure 1J는 옆의 실험과 같은 cell을 이용하였고 이를 mice에 이식하여 수행된 결과를 나타내는 것입니다. Figure I는 *로 표시된 TKI를 처리한 AXL overexpression(OX) PC9 cells가 일찍부터 drug resistance의 발현을 보임을 나타내고, Figure J는 TKI를 처리한 KO cell이 전혀 재발(relapse)되지 않았음을 나타냈습니다. 따라서, Figure1에서는 여러 실험 결과를 통해 GAS6의 receptor인 AXL과 GAS6가 TKIs(Osimertinib, Erlontinib)에 반응하여 활성화되면서 DTP cells의 resistance 발현을 유도하게 되어 lung caner cell의 치료 효과를 저하시킬 수 있다는 내용을 담고 있습니다.

 

figure 2 설명—--------------------------------------------------------------------------

 

이어서 figure 2와 3 앞부분 설명하겠습니다 figure 2의 A와 B는 tyrosine kinase inhibitor를 처리한 세포에 axl을 과발현시켜 cell viability와 apoptosis를 측정한 결과입니다. 먼저, PC9세포에 EGFR-TKi인 Erlotinib와 Osimertinib을 처리하였을 때 cell viability가 감소하고, early, late apoptosis가 증가한 것을 볼 수 있습니다. 이를 통해 RTK 억제가 잘 되었음을 확인하였으며, AXL 과발현을 통해 AXL 역할을 확인할 수 있었습니다. AXL을 과발현시킨 세포에서 EV(control)보다 cell viability가 높고 apoptosis 가 낮아진 결과를 보여줍니다. 이는 EGFR 돌연변이 폐암의 유발 요인으로 GAS6-AXL pathway가 관여할 수 있음을 나타냅니다. figure 2의 C는 tk inhibitor가 double strand break 즉 dsb를 증가시키지만 tk inhibitor를 처리한 세포에서 axl을 과발현시키면 dsb가 억제될 수 있음을 보여주는 결과입니다. c실험에서는 ɣ-H2AX가 DSB를 나타내는 마커로 사용되었습니다. (figure 2의 뒷 figure들에서 comet assay, DSB를 유도하는 ROS level, promoter부위의 DSB 측정을통해 추가적으로 검증할 수 있었습니다.) 따라서, figure2를 통해 TK inhibitor가 DNA fragmentation을 유도하지만 AXL은 이 반응을 약화시킨다는 것을 확인할 수 있습니다. 다음으로 figure 3의 B는 tki처리한 세포 중 axl 과발현 세포가 error dna polymerase 발현을 증가시키고 sos 유사반응을 활성화시킬 수 있음을 보여줍니다. tki처리 세포에서 AXL을 late activation시킴에 따라 4개의 high-fidelity polymerase와 몇몇 HR, mismatch repair (MMR) gene은 발현이 감소된 반면, low fidelity polymerase 발현이 증가되었음을 확인할 수 있습니다. 이는, 일반 polymerase에 의한 수선, 상동 재조합 수선, mismatch repair 보다 error를 무시하고 합성하는 SOS반응이 우세하게 일어난다는 결과를 보여줍니다.

 

figure 3 후반부—-------------------------------------------------------------------

 

다음으로 Figure 3F와 G에서는 AXL이 어떤 메커니즘을 통해 secondary mutation을 유도하는지 알아보기 위한 실험들을 진행하였습니다. 먼저, Figure 3F에서는 TKI 처리와 AXL 과발현 여부에 따른 다양한 protein들의 expression 정도를 보여주고 있습니다. TKI 처리와 함께 AXL을 overexpression 시켰을 때 RAD18의 ubiquitination은 감소하였고 PCNA의 ubiquitination은 증가하였습니다. 이를 통해 AXL이 RAD18와 interaction 함으로써 ubiquitination을 감소시키고 neddylation을 증가시킨다는 것을 알 수 있습니다. (AXL과 RAD18의 interaction은 Figure 3E에서 검증, neddylation 증가는 Figure S5B에서 검증) 결과적으로 Neddylation된 RAD18은 active state가 되고 ubiquitin-protein ligase로써 PCNA의 ubiquitination을 유도하게 됩니다. Figure 3G에서는 이러한 과정을 통해 실질적으로 AXL이 EGFR-mutant lung cancer에서 자주 나타나는 돌연변이인 T790M을 증가시키는지 보여주고 있습니다. PC9 cell에 TKI를 처리하였을 때 T790M은 증가하였고, AXL을 overexpression 시켰을 때 T790M은 더 증가하였음을 알 수 있습니다. 이를 통해 AXL로 인해 유도된 PCNA의 ubiquitination이 TLS polymerase를 recruit함으로써 mutability가 증가하게 된다는 것을 알 수 있습니다. 따라서 Figure 3에서는 AXL의 과발현이 RAD18의 neddylation, PCNA의 ubiquitination을 순차적으로 유도하여 error-prone DNA pol의 recruit를 통해 secondary mutation인 T790M을 증가시킨다는 결론을 낼 수 있습니다.

 

figure 4 설명—--------------------------------------------------------------------------------------

 

-figure 4 항목에서는 퓨린대사가 돌연변이 발생에 미치는 영향 및 상호 연관성에 관한 연구결과를 담고 있습니다. -DNA 복제의 fidelity(정확성)은 dNTP들의 양과 비율(dNTP pool)의 영향을 받습니다. 즉, 퓨린과 피리미딘의 비율이 proofreading과 돌연변이 발생에 영향을 미칩니다. -한편, 암세포는 metabolic alteration이라고 하는 정상적인 세포와는 다른 물질대사를 수행합니다. 본 논문에서 AXL-KO세포와 정상세포 간의 물질대사 산물을 측정한 결과, AXL-KO 세포에서 IMP, GMP는 감소한 반면, 아데닌, 구아닌, 아데노신의 양은 증가한 것이 확인되었습니다. 반대로 AXL이 과발현된 세포에서는 상기 대사산물들이 증가한 것이 확인되었습니다. -상기 퓨린합성과정이 AXL의 영향을 받는다는 것을 확인하기 위해 실험을 수행하였습니다. 방사성 동위원소를 사용하여 IMP의 퓨린고리의 두 군데를 마크하여 추적한 결과(m+2), naive cell에서 많은 양이 확인되었습니다. 두 번째 그림을 보면 WT보다 KO에서 m+2가 감소된 것이 확인되었습니다. (AXL과발현에서 IMP증가, AXL-KO에서 IMP감소) -그리고, (3번째 그림) AXL의 과발현이 MYC 프로모터를 활성화시키는 것을 확인하였습니다. ----> 상기 결과들을 종합하여 보면, TKI 약물을 투여하면, AXL은 증가되어 MYC를 활성화시킵니다. 이는 퓨린 불균형을 야기합니다.(purine mutational bias, PuMB) TKI를 투여한 암세포와 control을 비교해 보았더니 TKI를 투여한 세포에서 PuMB의 증가가 확인되었습니다. 게다가, 돌연변이 EGFR 종양에서 와일드 타입 EGFR보다 더 PuMB가 높다는 것을 알게 되었습니다. 종합해보면, TKI는 AXL과 MYC를 활성화시키고 뉴클레오타이드의 물질대사에 영향을 미쳐 불균형을 일으키게 하여 돌연변이 발생이 증가합니다. 폐암의 경우, AXL의 높은 발현과 GAS6과의 발현량 차이는 환자의 증세를 약화시킵니다/생존성을 감소시킵니다. 반대로 AXL-KO 세포의 경우 상대적으로 종양이 덜 성장하였으며, 군집도 덜 형성하였습니다.

 

figure 5, 6 설명—-------------------------------------------------------------------------------

 

제가 분석한 figure는 여러 종류의 anti-AXL 단일항체들이 tumor relapse, 즉 종양 재발에 어떤 영향을 미치는지에 대한 내용입니다. 첫번째 그림인 figure 5은 anti-AXL 단일항체들을 임의로 3개씩 섞어서 처리했을 때의 종양 재발 정도를 표로 나타낸 것입니다. 이 그림을 보면 osimertinib과 cetuximab, anti-AXL 654를 섞은 triplet이 다른 combination들과는 다르게 tumor relapse를 완전하게 제거하는 것을 확인할 수 있었습니다. 두번째 그림인 figure 6은 위의 그림과 다르게 osimertinib을 tumor에 미리 처리해 내성을 가지게 해 놓았습니다. 빨간색 상자 위에 Osi라고 표시된 부분입니다. Figure 5처럼 tumor 재발의 완전한 억제 효과를 보았던 triplet을 처리했을 때, 똑같이 재발이 되지 않는다는 것을 확인할 수 있었습니다. 즉, AXL-tumor는 짧은 anti-AXL treatment를 해주면 재발에 대한 저항성을 가진다는 것을 알 수 있었습니다.

 

SPARK 1차 1조 포스터.pdf

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