일반생물학 및 실험(1) - BAC 용액을 이용한 Bradford Assay 단백질 정량 측정 실험 보고서

개요

본 보고서는 3월 23일 2023년도에 진행된 Bradford Assay 방식을 통해 BAC 시약으로 용액 내의 단백질의 함량을 측정 및 관측한 일반생물학 실험에 대한 보고 및 사후 평가에 관한 보고서이다.

 

실험 목적

생물체 내에 액체상태로 존재하는 단백질 분자를 BCA 시약을 사용하는 정량적으로 분석하는 Bradford Assay 측정방법을 배우고 실험을 통해 산출된 결과를 해석해본다.

 

실험결과

 

측정된 단백질 흡광도	0.29	0.327	0.35	0.354	0.587	0.285
예상단백질 농도	-21.33	3.33	18.67	21.33	176.67	-24.66

기준단백질 농도	흡광도
0	0.261
10	0.336
20	0.292
40	0.511
60	0.471
80	0.428
100	0.412
200	0.605

Discussion

1. 실험 원리

 

1.   BSA의 단백질 농도에 따른 흡광도를 미리 알고 있으므로 이것을 기준으로 사용하여 미지의 용액에 단백질이 얼마나 들어있는지 알아낸다.
2.   미지의 단백질 용액에 coomassie blue G-250이라는 염색약을 사용하여 단백질을 푸른 색으로 염색한 후, 자외선 측정기계를 사용하여 특정한 파장을 분석한다. 단백질 농도가 짙을수록 흡광도가 비례하여 커진다.
3.   BSA 기준 단백질의 농도와 흡광도는 비례하므로 단백질 농도-흡광도 그래프는 일차함수의 모양을 띤다. 이때 미지의 단백질측정값의 그래프의 신뢰도가 0.99퍼센트 이상이면 성공적인 실험이라고 평가된다.
4.   실험 결과로 산출된 그래프로부터 직선의 추세선을 그리고 그 추세선의 일차함수 식에 측정하고자 하는 단백질 용액의 흡광도를 계산하였다.

 

2. 실험 결과 분석

 

 1) 실험 결과로 나온 추세 그래프의 일차함수 식의 신뢰도는 약 66퍼센트로 계산되었다. 이는 목표한 신뢰도와 크게 벗어나 오차가 크고 신뢰성이 다소 떨어지는 결과로 판단하여 실험에 실패했다는 결론에 도달하였다.

 

3. 실험 오류 분석

 

 1) 실험에 사용한 용액이 골고루 섞이지 않았을 가능성

 

 2) 용액의 정량 적정에 실패하였을 가능성

 

• milk 와 DW 혼합과정에서 1/500 희석용액의 일부를 취하여 1/2500 용액 희석에 사용하였고 1/1000용액의 일부를 취하여 1/5000 용액 희석에 사용하였다. 이는 이후 계산에서 0.01 마이크로 리터 단위로 적정을 해야 한다는 결과가 밝혀졌고 현실적으로 정밀적정이 어렵다고 판단하였다.

 

 3) 실험에서 사용한 단백질 milk가 100% 단백질이 아닐 가능성

 

실험에서 사용한 milk에 지방, 수분 등이 포함되어 계획했던 기준 단백질 농도 산출되지 않았을 것이라고 사료된다.

용액 희석 과정에서 milk를 상온에 너무 오래 노출시켜 단백질이 변형이 일어났을 가능성

Furthur study

Q1. Bradford Essay 방법 수행 시 BSA 외 다른 기준단백질은 무엇이며 이들간의 유사성은 무엇인가?

 

A1. BSA 외 BGG(Bovine Gamma Globulin) 또한 기준단백질로 사용된다. 이때 BGG 역시 소의 피에서 뽑아낼 수 있는데 BSA처럼 BGG도 용액속에 잘 녹는 용질이고 또 소의 피에서 쉽게 구할 수 있으며, 마지막으로 매우 순수하게 정제할 수 있어서 실험용 기준단백질로 사용하기 적합하다.

 

 

그 외 기준 단백질로 사용되는 것들은 아래와 같다.

 

• 1. 오발부민: 오발부민은 계란 흰자를 구성하는 주요 단백질이다.
• 2. 베타갈락토시다아제: 베타갈락토시다아제는 박테리아 속에서 발견되는 효소 단백질의 일종이다.
• 3. 사이토크롬 C: 미토콘드리아나 원핵세포 속에서 추출할 수 있는 단백질 종류이다.
• 4. 헤모글로빈: 헤모글로빈은 적혈구 세포속에 있는 단백질 종류로 몸 곳곳에 산소를 이동시키는 역할을 한다.
• 5. 미오글로빈: 미오글로빈은 철과 산소가 결합된 단백질이며 동물의 근육세포 속에서 주로 발견된다.

이들 단백질은 모두 유기체로부터 만들어진다는 공통점이 있다. 그리고 이들 단백질들은 용액에 잘 녹는 성질이 있다. 용액에 잘 녹으면 실험용 시약을 만들기 용이하다. 게다가 기준 단백질들은

생물체에서 비교적 쉽게 추출이 가능해 지속적이고 안정적인 공급이 가능하다.

 

Q2. 미지의 용액 속 단백질의 정량분석하는 다른 방법들은 무엇인가? 또한, 이러한 방법들의 화학적 메커니즘은 무엇인가?

 

A2.

• BCA ASSAY: 단백질은 구리이온을 만드는데 bicinchoninic acid와 구리이온이 만나면 보라색 빛이 난다. 이때 이 보라색 빛의 특정파장을 측정하여 단백질의 농도를 측정한다.
• 로우리 Assay: 가장 오래된 단백질 분석 방법으로 구리시약을 단백질에 첨가하면 구리와 단백질이 펩타이트 결합을 하면서 복합구조를 만들어 낸다. 이때 만들어진 펩타이트 결합을 분광기법으로 분석한다.
• 자외선 흡수율 측정: 단백질을 구성하는 특정 아미노산은 280nm의 자외선을 흡수하는 성질을 갖는데 측정 단백질에 자외선을 쪼이고 자외선 흡수율을 분석하여 단백질의 농도를 측정한다.
• 형광물질 사용: 특정 형광물질은 단백질에 달라붙는 성질이 있는데 이러한 형광물질들을 단백질과 섞은 후, 특정 파장의 빛을 쪼여주면 단백질에 형광물질이 염색된다. 이 색을 가지고 단백질을 분석한다.

사후 검토

단위에 대한 명확한 이해없이 실험에 임하여 실험 중 상당한 혼동을 겪었다. 다음에 실험에 임할 때는 예비보고서를 더욱 숙지하여 기본적인 단위 및 실험 도구, 용어 등은 암기한 후 실험에 임해야 한다고 생각하였다.