일반생물학 및 실험(2) Polymerase Chain Reaction 증폭 실험 보고서

1. 실험제목 날짜

 

본 실험 보고서는 2023년 6월 14일 진행된 PCR기법을 사용한 DNA 증폭 실험에 관한 내용을 담고 있습니다.

 

 

2. 실험목적

 

-PCR 기법이란?

 

연구하고자 하는 특정 DNA를 증폭 즉, 복제시키는 기술입니다. 원하는 DNA 염기서열, 즉 타겟시퀸스를 여러 벌로 증폭시켜 다양한 연구 및 실험에 사용할 수 있습니다. 총 30회로 진행되는 DNA 복제 과정 중 1회를 진행하여 PCR 증폭의 원리를 이해하고 진행 절차를 숙지하는 것, 마지막으로 전기영동에 의한 결과를 분석하는 것을 본 실험의 주 목적으로 하고 있습니다.

 

 

3. 실험결과 및 Result

 

 

-본 실험의 전기영동 과정에서 1kb DNA ladder, 0.7%아가로스 젤이 사용되었습니다.

 

-전기영동을 수행하여 질량이 작은 물체가 더 빠르게 젤을 통과하여 질량을 통한 복제된 DNA의 존재를 관찰할 수 있었습니다.

 

-전기영동 결과(3조), 비교적 선명한 결과를 관찰할 수 있었고, PCR 기법을 통한 타겟 DNA 복제가 잘 수행되었음을 확인하였습니다. 복제하고자 하는 DNA의 염기서열만에 선명하게 관찰되었으며 타겟 시퀸스 외의 부분은 복제가 되지 않은 것을 관찰하였습니다.

 

 

4. Discussion

 

-PCR 증폭의 기본원리: 본 기법은 DNA 중합효소를 사용하여 필요한 DNA를 여러 벌로 복제합니다. PCR 증폭은 세 단계로 진행되는 1회 복제를 약 30회 진행하여, 1회당 2배 즉, 30회를 통해 2의 30제곱의 복제된 DNA를 얻어낼 수 있습니다.

 

1단계: 복제하고자 하는 DNA가 주형가닥으로 작용됩니다. 이 주형가닥 DNA에 열을 가하면 DNA의 염기쌍의 수소결합이 깨지게 됩니다. 이러한 현상을 denaturation 이라고 합니다. 한편, denature 과정에서는 적절한 온도가 중요한데 한가지 예로 G-C염기쌍이 많이 존재하는 DNA는 A-T염기쌍 비율이 높은 DNA보다 더 높은 온도에서 denature 됩니다. 왜냐하면 C-G염기쌍은 A-T 염기쌍보다 수소결합이 1개 더 많기 때문에 좀더 높은 온도가 염기쌍 분리에 필요합니다. 현재 PCR 검사에 필요한 온도를 알려주는 프로그램이 개발되어 C-G 염기쌍에 비례하여 적절한 온도를 알려줍니다.

 

2단계: 온도를 조금 낮춘 후 수소결합이 깨진 DNA에 primer가 붙도록 유도합니다. 이때, primer는 약 15-20뉴클레오타이드로 구성된 올리고-뉴클레오타이드이며, 복제하고자 하는 타겟 시퀸스와 상보적 염기쌍을 가지고 있어 해당 서열에 잘 붙을 수 있게 됩니다. 이러한 과정을 annealing이라고 합니다.

 

3단계: 3단계는 extension 과정이라고 불리며, DNA 중합효소가 프라이머가 결합된 부분에 부착되어 DNA를 복제해 나갑니다. 이때 적절한 온도를 유지하여 중합효소의 활성도를 조절할 수 있습니다.

 

상기 1단계, 2단계, 그리고 3단계의 과정을 30회 반복하여 복제하고자 하는 DNA를 최대 2의 30제곱 염기쌍을 얻을 수 있습니다.

 

 

5. furthur study

 

문제1) 통상 프라이머는 약 18-25뉴클레오타이드 정도로 구성되어 있다. 그 이유에 관하여 서술하시오

 

답) 위와 같은 길이의 뉴클레오타이드를 올리고뉴클레오타이드라고 합니다. 이때 올리고는 작다라는 뜻입니다. 한편, PCR 검사에서 약 18에서 25 뉴클레오타이드로 구성된 프라이머를 사용하는데, 이는 이 정도의 길이가 DNA 합성에 필요한 충분한 양이기 때문입니다. 프라이머의 양이 이보다 적으면 중합효소가 프라이머에 적절히 붙지 못할 수도 있습니다. 더욱 길고 정확한 DNA를 복제하는 PCR 과정에서는 약 30 뉴클레오타이드 길이의 프라이머를 사용하기도 합니다. 하지만 프라이머가 너무 길어지게 되면 프라이머 끼리 상보적인 염기쌍을 가질 확률이 높아지게 되며, 이는 프라이머끼리 annealing 되는 결과를 야기할 수 있습니다. 또한 Prime의 길이가 너무 길어지면 RNA인 프라이머는 이차구조(십자가형, 머리핀형)을 형성하여 PCR 복제에 제약이 될 수 있습니다.

 

 

문제2) Taq 폴리머레이즈와 Pfu 폴리머레이즈를 비교 설명하시오

 

Pfu 중합효소는 극호열 고세균 (Pyrococcus furiosus)에서 추출한 중합효소로써 Taq 중합효소보다 더욱 열 저항성이 강한 것으로 관찰되었습니다. 한편 Pfu 중합효소는 더 높은 proofreading 능력을 갖추고 있어 PCR기법에서 더욱 오차가 적은 정밀한 복제를 보입니다. Pfu 중합효소가 5‘에서 3’ 방향으로 복제를 진행할 때, exonuclease는 역으로 오류검사를 진행하여 더욱 높은 복제의 정확도를 가질 수 있습니다. 열 저항성이 더 높기 때문에 복제 및 PCR 수행이 가능한 온도범위가 더욱 높습니다. 따라서 온도에 의한 복제 정확도의 영향을 더욱 적게 받을 것이고 이는 결과적으로 PCR의 정확도를 향상시키는 결과를 가져올 수 있다고 사료하였습니다.

 

 

6. reference

• Pfu 중합효소: https://en.wikipedia.org/wiki/Pfu_DNA_polymerase
• Campbell biology, 12판