일반생물학 및 실험(2) - 대장균내 플라스미드 DNA삽입 실험

1. 실험제목 날짜

 

이 실험 보고서는 2023년 10월 5일 진행한 형질전환을 위한 대장균내 플라스미드 DNA 삽입 실험 보고서입니다.

 

 

2. 실험목적

 

본 실험은 플라스미드 DNA를 직접 대장균 내에 주입하여 대장균에 새로운 표현형 또는 유전자형을 갖게 하는 형질전환의 개념을 이해하고 기본적인 형질전환 실험 수행방법을 익히는 것을 주 목적으로 하고 있습니다.

 

 

3. 실험결과 간단설명

 

 

competent cell 속에 항생제 저항성 플라스미드를 넣어 형질전환시킨 후, 항생제가 들어있는 배지에 넣어서 배양하였습니다. 그 결과, 세균이 항생제 배지속에서 증식하여 하얀색의 콜로니를 형성한 것을 확인하였습니다. 이에 따라 항생제 저항성 플라스미드가 세균 내에 형질전환 된 것을 확인하였습니다.

형질전환이 안되어서 항생제 저항성 플라스미드를 가지고 있지 않은 세균들의 경우, 항생제 배지에서 생존하지 못하여 군집을 형성하지 못합니다.

 

 

4. 실험원리

 

형질전환(transformation)

 

형질전환은 유전자 재조합 기술을 사용하여 세균의 DNA 내에 타겟 DNA를 넣어 세균의 표현형 또는 유전자형이 변화하는 것을 말합니다. 이때 외부에서 유래된 타겟 DNA는 동일 종 그리고, 다른 종의 DNA를 포함합니다.

 

형질전환의 예로는 그리피스가 1928년 수행한 결핵균의 형질전환 실험이 있습니다. 그의 실험에서 피막이 없는 R 형 균은 피막이 있는 S형 균으로부터 DNA를 받아 S형으로 형질전환된 것이 관찰되었습니다. 다른 예로는 같은 종 의 세균들이 서로 접합을 하여 항생제 저항성 플라스미드 등을 주고받아 형질전환하는 예를 들수 있습니다. 이때, 성선모 또는 선모를 통해 접합이 이루어지며 이 관을 통하여 플라스미드가 이동합니다.마지막 예로는 박테리아 파지 바이러스로부터 DNA를 받는 경우가 있는데, 바이러스의 용원성 생활사로 인해 세균의 DNA에 바이러스의 DNA가 포함되는 경우, 또는 바이러스가 증식되어 나갈 때, 세균이 생존하고 바이러스가 세균의 DNA를 가지고 나가서 세균 내에 바이러스의 DNA가 남아있는 경우, 세균이 형질전환되어 해당 바이러스에 대한 저항성을 띠게 되는 것이 관찰되곤 합니다.

 

원형 플라스미드 DNA는

 

(1) 복제원점은 복제가 시작되는 지점으로 A-T 염기쌍이 주를 이루며, 양방향으로 복제가 이루어집니다.

 

(2) selection marker는 주로 항생제에 대한 저항성을 가지고 있는 유전자 부분입니다. 해당 항생제 배지에서 세균을 배양하면 특정 selection marker가 있는 세균만 남게 됩니다.

 

(3) multiple cloning site는 제한효소로 잘릴 수 있는 다양한 서열을 가진 DNA 조각입니다. 이곳에 특정 DNA를 제한효소를 사용하여 삽입 후 세균에 형질전환 시킨 후 DNA 복제가 이루어집니다.

 

5. Discussion

 

실험 결과, 육안으로 식별 가능한 세균 콜로니가 관찰되었고, 이에 따라 실험이 성공적으로 수행되었음을 알 수 있었습니다.

 

예비군 훈련으로 인해 실험에 참여하지 못하였지만, 실험 결과로 미루어 보아 절차대로 실험이 진행되었음을 알 수 있었습니다.

 

 

6. furthur study

 

DNA 절편은 세균의 DNA 또는 플라스미드 DNA와 달리 세균내에서 복제가 가능하지 않는 이유에 관하여 서술하시오.

 

• 그냥 DNA 절편을 세균에 넣을 경우, 세균의 방어시스템은 외부 DNA를 인식하여 파괴합니다. 대표적인 방어 시스템으로 crisper cas 9 이 있는데 guide RNA와 crisper cas 단백질 복합체가 외부의 특정 DNA를 인식하여 파괴하는 기능을 가지고 있습니다. 다른 외부 DNA 방어 시스템으로는 DNase, RNase 등의 핵산분해효소 그리고, 제한효소 등이 있는데 이러한 효소들은 외부 DNA를 인식하며, 메틸화되어서 보호되지 않는 핵산을 파괴합니다.

 

• 한편, DNA 조각은 복제원점이 존재하지 않아 세균 내에서 복제가 불가능합니다. 세균 내에 존재하는 전사인자와 중합효소는 복제원점의 염기서열을 인식하고 해당 부위에 결합하여 복제를 진행하는데, 복제원점이 존재하지 않으면 이러한 과정이 발생되지 않습니다.

 

 

7. reference

• Campbell biology, 12th global edition, San Francisco: Pearson Benjamin 2021
• 네이버 지식백과 https://terms.naver.com/entry.naver?docId=5569117&cid=61233&categoryId=61233 “대장균 형질전환”