일반생물학 및 실험(2) - 전기영동을 통한 제한효소 활성관찰 실험 보고서

실험제목

본 실험 보고서는 2023년 9월 21일 진행된 수용액내 제한효소 활성의 유도와 (in vitro) 전기영동을 통한 결과관찰에 대한 보고서입니다.

 

 

실험목적

• 대장균은 바이러스로부터 자신을 보호하기 위해 제한효소라는 시스템을 가지고 있습니다. 이러한 제한효소가 바이러스의 핵산에 대한 작용을 실험을 통해 관찰하고 작용 메커니즘에 대하여 이해함을 본 실험의 목적으로 하고 있습니다.
• 또한, 바이러스의 핵산을 분해하는 제한효소들의 종류와 각각 효소의 작동 메커니즘에 대해 학습함을 목적으로 하였습니다.
• 마지막으로, 제한효소에 의해 잘려진 바이러스의 핵산을 gel electroporesis를 통하여 관찰하였습니다.

 

실험결과

 

 

-실험결과, A와 B 시험관 용액이 들어간 well은 예상한 결과가 도출되지 못하였습니다.

 

-시험관 C 또한 예상과는 다른 결과가 도출되었습니다. 제한효소가 적절히 활성화되지 못하였고, 바이러스의 DNA가 절단되지 못하여 질량이 가장 큰 형태로 젤 위쪽에 자리를 위치한 것을 식별하였습니다.

 

-한편, 젤의 가장 왼쪽 well에는 마커 용액을 집어넣어 전기영동을 수행하였는데, 이를 통해 분산된 각각의 마커와 수평적으로 위치하는 물질의 질량을 마커와 비교, 관찰할 수 있도록 하였습니다. 따라서, 가장 위쪽에 존재하는 마커는 10 kilo basepair의 질량을, 즉, 1만개의 염기쌍에 해당하는 질량을 가집니다.

 

-전기영동에 사용한 젤은 1% agarose 젤을 사용하였는데, 농도가 높은 젤은 더욱 촘촘한 그물망을 형성하여 전기영동 결과, 각 서로 다른 질량의 물질간의 간격을 더욱 크게 만듭니다. 궁극적으로 이는 관찰의 용이성을 증가시킵니다.

-예비 보고서 상에 존재하는 표는 실제 전기영동을 실시한 젤의 물질 간의 거리를 측정하여야 하지만 본 실험에서는 항온수조 및 전기영동 과정을 생략하여 표 작성에 제약이 있었습니다.

 

 

discussion

 

본 실험에서 각 시험관에 투입된 용액은 아래와 같습니다.

• 시험관 A: 10x 완충용액 6(Eco, Hind 각각 3), 람다 DNA 5, DW 49, 제한효소 0
• 시험관 B: 10x 완충용액 6(Hind 6), 람다 DNA 5, DW 48, 제한효소 1(Hind3)
• 시험관 C: 10x 완충용액 6(Eco 6), 람다 DNA 5, DW 48, 제한효소 1(Eco R1)

(단위: 마이크로 리터)

 

 

3조 실험결과 분석(전기영동 결과 분석)은 아래와 같습니다.

 

-전기영동을 수행한 agarose gel의 첫 번째 well은 핵산의 크기를 식별하기 위한 마커가 들어있습니다.

 

-두 번째 well은 제한효소가 들어있지 않기 때문에 바이러스의 DNA가 잘리지 않은 채로 관찰되어야 합니다. 따라서 예상한 결과는 젤의 가장 위쪽에 가장 질량이 큰 물질이 식별이 되는 것이었습니다. 하지만, 실험과정 중 실험자의 미숙함으로 인해 바이러스의 DNA가 시험관 내에 적절히 들어가지 못한 것으로 사료되었습니다.

 

-세 번째 well의 경우, DNA가 제한효소에 의해 잘려 층을 형성하는 결과를 예상하였습니다. 하지만 이 또한 DNA 용액이 시험관 내로 적절히 들어가지 못하여 핵산이 젤 내에서 관찰되지 못하는 결과를 야기하였습니다.

 

-네번 째 well은 시험관 C의 용액을 전기영동한 결과로, 바이러스의 DNA는 적절히 들어갔음이 젤을 통해 관찰되었습니다. 하지만 제한효소가 적절히 들어가지 못하여 DNA가 제한효소에 의해 잘리지 못하고 온전한 상태를 유지하고 있었습니다. 잘리지 않은 DNA는 질량이 커 젤을 느리게 통과하므로 젤의 가장 위쪽에 위치하고 있음이 관찰되었습니다.

 

-본 실험을 통하여 시험관내 10 마이크로 리터 이내의 용액의 투여에 상당한 숙련도가 요함을 알게 되었습니다. 피펫 사용시 용액이 들어있는 시험관을 눈높이로 들어서 용액을 피펫에 담고, 두손으로 피펫을 고정하여 용액 적정시 흔들림을 최소화해야 함을 배웠습니다. 한편, 용액을 피펫에 담을 때 기포가 들어가지 않도록 취급해야 함을 알게 되었습니다.

 

 

실험원리

 

박테리오 람다파지:

 

상기 바이러스는 대장균을 감염시켜 숙주로 삼아 증식과 생명활동을 수행합니다. 바이러스의 생활사는 용균성 생활사와 용원성 생활사로 나눌 수 있는데 전자는 바이러스가 숙주 내로 침투하여 숙주의 영양분과 효소를 사용하여 자신의 핵산과 단백질 껍질을 복제한 후 조립된 후 숙주의 세포막을 뚫고 나와 결국 세포를 죽이게 됩니다. 반대로 후자의 경우, 바이러스가 프로파지의 형태로 숙주의 핵산 즉, 원형 DNA 또는 플라스미드에 자신의 핵산을 끼워넣어 숙주가 증식하며 자신의 DNA를 복제할 때, 바이러스의 DNA도 복제가 되는 형태를 취하고 있습니다. 당장은 용원성 생활사는 숙주세포를 치사시키지 않지만 환경의 변화, 예컨대 화학물질 또는 영양분의 부족 등으로 용원성 생활사에서 용균성 생활사로 또한, 그 반대로 진행될 수 있습니다. 본 실험에서 다루는 람다파지의 경우, 용원성 생활사를 주로 보이며 꼬리가 한 개 달려있는 특징이 있습니다.

 

상기 생활사를 통한 바이러스의 침투를 방해하기 위해 대장균은 제한효소라는 기능을 갖추고 있습니다. 이 제한효소는 특정 DNA 염기서열, 예컨대 람다파지의 핵산, 의 특정 부위를 인식하여 절단하는 효소입니다.이러한 효소를 대장균으로부터 추출하여 다양한 생물학적 용도로 활용할 수 있습니다.

 

제한효소는 대표적으로 두가지 계열로 구분할 수 있는데 한가지는 Hae3 계열이고, 다른 한가지는 BamH1 계열입니다. Hae 3의 경우 4개의 염기를 인식하여 blunt end를 형성하며 DNA를 절단합니다. BamH1의 경우, 6개의 염기를 인식하여 sticky end로 DNA를 절단합니다. 한글로는 각각 비점착성 말단 ,그리고 점착성 말단으로 불립니다.

 

-제한효소의 명명법: 제한효소는 해당 제한효소로 추출한 균주의 속의 첫글자를 대문자로 쓴 후 종의 두 글자를 소문자로 붙여쓴 후 마지막을 이텔릭 체로 기울여 쓰는 명명법을 따르고 있습니다. 예를 들어 Haemophilus influenzae Rd로부터 Hind 3제한 효소를, Klebsiella pneumoniae OK8으로부터 Kpn 1을, 마지막으로 Serratia marcescens 로부터 Sma1 효소를 추출해 낸 후 각각 명명법에 따라 명명하였습니다.

 

 

furthur study

-1973년 실행된 Herbert boyer의 restriction enyzme을 이용한 핵산의 재조합 실험에 관하여 서술하시오.

 

-보이어 박사는 대장균의 원형 플라스미드 DNA를 제한효소로 자른 후 원하는 DNA 조각을 잘린 부위에 이어 붙였습니다. 이러한 과정을 DNA 재조합이라고 합니다. 이때, 대장균의 DNA에 외부의 DNA가 들어와 대장균의 표현형 또는 유전자형이 바뀌었으므로 DNA 재조합으로 인해 대장균은 형질전환되었다고 할 수 있습니다.

 

-이때, 형질전환된 대장균은 이분법을 통해 증식하며 자신의 DNA를 복제하는데, 보이어 박사에 의해 끼워넣어진 DNA도 같이 복제하게 됩니다. 상기 과정을 DNA 클로닝이라고 합니다.

 

-보이어 박사는 GAATTC 유전자 서열을 인식하여 자를 수 있는 제한효소 EcoR1을 발견하였으며, 이 제한효소를 사용하여 대장균의 플라스미드를 잘라 원하는 DNA를 끼워넣을 수 있게 되었습니다. 이후 인슐린을 대장균 내에서 합성하고자 하는 연구가 진행되었습니다. 대장균에는 핵산분해효소가 들어있는데 이 효소가 인슐린의 DNA를 외부 DNA로 인식하여 파괴하는 것이 연구의 해결주제였습니다. 보이어 박사는 커다란 대장균의 단백질에 인슐린 DNA를 넣어서 핵산분해효소가 인슐린의 DNA를 인식하지 못하도록 단백질 복합체를 만들어 대장균 플라스미드 내에 넣었습니다.

 

-결국 인슐린 유전자로 인한 대장균의 형질전환은 대장균이 인슐린을 합성할 수 있도록 하였으며, 오늘날 당뇨병 환자에게 널리 쓰이는 인슐린을 대량생산 할 수 있었습니다. 본 보고서의 실험은 보이어 박사의 유전자 재조합 실험의 기본 원리를 재현한 실험으로의 그 의의를 가지고 있습니다.

 

 

reference

 

• Campbell biology, 12th global edition, San Francisco: Pearson Benjamin 2021
• http://m.dongascience.com/news.php?idx=8277
• https://www.ibric.org/bric/trend/bio-series.do?mode=series_view&newsArticleNo=8815978&articleNo=88827 16&beforeMode=latest_list#!/list
• https://ko.wikipedia.org/wiki/%EC%9C%A0%EC%A0%84%EC%9E%90_%EC%9E%AC%EC%A1%B0%ED%95%A9