일반생물학 및 실험(2) -폴리아크릴아마이드 젤 전기영동을 이용한 부피에 따른 단백질 분리 정제 실험 보고서

1. 실험제목

 

이 보고서는 11월 16일 목요일 과학원 SB202호실에서 진행된 폴리 아크릴아미이드 젤 전기영동을 이용한 부피에 따른 단백질 분리정제 실험에 관한 내용을 담고 있습니다.

 

 

2. 실험목적

 

본 실험의 목적은 SDS를 사용하여 단백질의 전하를 모두 음전하로 바꾼 후 젤 전기영동을 실시하여 질량에 따른 단백질의 분리 및 단백질의 질량 확인을 하는 것입니다. 본 실험을 통하여 SDS의 원리를 이해하며, SDS-PAGE 방법의 원리와 실제 사용법을 숙지할 수 있었습니다.

 

 

3. 실험결과

 

 

-사진상에는 총 6개의 컬럼이 있습니다. 3개의 조에 각각 2개의 컬럼씩 할당되어 왼쪽 컬럼에는 ladder, 오른쪽 컬럼에는 단백질 용액을 load하여 전기영동을 실시하였습니다.

 

-3조는 ladder가 부족하여 1,2조보다 적은 양을 load하여 전기영동 하였습니다. 따라서 1, 2조의 ladder에 비해 3조의 ladder는 흐리게 나타났습니다.

 

-3조의 SDS-PAGE 결과, 총 3개의 단백질 띠가 관찰되었는데 ladder와 비교한 결과, 아래쪽에서부터 56, 70, 175kDa의 질량을 가진 단백질로 확인되었습니다.

 

-1조의 전기영동 결과는 ladder와 매우 비슷하여 ladder 용액 단백질 용액과 섞인 것으로 사료되었습니다.

 

-2조의 경우, 95, 175kDa 질량을 가진 단백질 띠가 나타나지 않았는데, 이는 단백질 용액이 문제가 있어 생긴 결과라고 생각되었습니다. 단백질의 양이 너무 적어서 단백질 띠가 육안으로 식별되지 못한 점도 생각해 보았습니다.

 

 

4. Discussion

 

SDS

 

SDS는 sodium dodecylsulfate의 약자입니다. SDS는 양전하를 띠어 친수성인 머리부분과 탄소 12개로 되어 있는 소수성 꼬리부분을 둘다 가지고 있어서 계면활성제의 역할을 하게 됩니다. SDS는 접혀진 단백질의 소수성 안쪽까지 침투하여 단백질의 구조를 다 무너뜨립니다. 게다가, 친수성 머리부분을 가지고 있어서 단백질을 물에 녹입니다. 아미노산 2개당 SDS 1개가 붙어서 단백질 고유의 전하를 없애고 음전하를 띠게 합니다. 따라서 단백질 용액은 젤의 양전하 쪽으로 이동하게 됩니다.

 

*계면활성제: 물과 기름을 섞을 수 있는 물질, 소수성 부분과 친수성 부분을 모두 가지고 있다.

 

SDS-PAGE

 

SDS-아크릴 아마이드 젤 전기영동은 SDS로 처리한 단백질을 무게에 따라 분리하는 방법입니다. 단백질의 크기가 크면 마찰계수가 커져서 젤을 통과하는 속도가 느려지게 됩니다. 반대로 단백질의 크기가 작으면 젤을 통과하는 속도가 상대적으로 빨라집니다. 따라서 전기영동 결과, 젤의 위쪽은 비교적 크기가 큰 단백질들이 위치하게 되고, 크기가 작은 단백질들은 아래쪽에 위치하게 됩니다. 젤의 농도가 짙으면 젤이 이루는 그 물구조는 더 촘촘해지고 단백질이 통과하는 속도는 감소하게 됩니다. 또한, 전기영동 시 전압을 높이면 단백질의 통과가 더 빨리 일어납니다

 

 

5. furthur study

 

• SDS-PAGE와 네이티브-PAGE 간의 차이를 비교, 설명하시오.

 

Native-PAGE는 protein의 3차구조를 변형시키지 않은 채로 젤 전기영동을 실시하는 것이 SDS-PAGE와 다른 차이입니다. 이 방법은 단백질의 모양과 분자량에 따라서 단백질을 나눕니다. SDS-PAGE는 계면활성제를 사용하여 단백질의 모양이 긴 polypeptide 사슬로 변하여 분자량당 같은 전하를 가지며, 모양의 영향을 받지 않습니다. 하지만 네이티브 페이지는 단백질의 모양, 및 고유의 전하에 영향을 받습니다. 다른 등전점을 가진 단백질, 분자량이 다른 단백질은 네이티브 페이지로 분리가 불가능합니다.

 

네이티브 페이지는 SDS 페이지처럼 두 개의 젤로 구성되어 있습니다. pH6.8, 낮은 농도의 축적 겔(stacking gel)에 먼저 단백질 용액을 주입하면, 단백질이 나트륨 이온, glycine 등에 의해 발생되는 전하의 기울기에 이동합니다. 이동하여 pH 8.8, 비교적 높은 농도의 분해 겔(resolving gel)로 모이게 된 단백질 용액은 단백질의 자체 전하 그리고, 크기에 따라 분리됩니다.

 

네이티브 페이지는 3가지 종류로 나뉩니다.

 

1. Blue native PAGE

 

Coomassie Brilliant Blue 염색약을 사용하여 전기영동하는 방법입니다. 염색약이 단백질이 전하를 띠게 하고 이는 전기장이 걸리면 단백질을 움직이게 합니다. 염색이 되어 있기 때문에 단백질이 육안으로 잘 식별되는 장점이 있고, 단점으로는 염색약이 계면활성제로 작용하여 단백질을 분해하기도 합니다.

 

2. Clear native PAGE

 

단백질 고유의 전하를 사용하여 단백질을 분리하는 것입니다. 단백질의 모양의 영향도 받습니다.

 

3. Quantative native PAGE

 

네이티브 페이지를 통해 분리된 단백질을 다른 분석법을 통해 단백질의 양을 정량적으로 측정합니다. 예를 들면 단백질이 가지고 있는 금속의 양을 측정하여 단백질의 양을 간접적으로 알 수 있습니다.

 

 

 

• 50kDa 의 질량을 가진 단백질을 SDS-PAGE를 시행하였다. 이때, 단백질 밴드가 50kDa보다 마커보다 조금 위쪽에 있는 것이 관찰되었다. 이러한 결과가 발생한 이유를 서술하시오.

 

1) 우선, 실험자의 실수를 먼저 고려해 보았습니다. 단백질을 SDS-PAGE 시행할 때, 전압을 건 채로 마커를 단백질보다 먼저 넣었고 마커가 먼저 이동하여 50kDa의 마커가 더 아래쪽에 위치할 수 있습니다.

 

2) 두 번째로 단백질의 모양이 이동속도에 영향을 줄 수 있습니다. SDS-PAGE는 선형의 단백질의 이동을 상정하고 수행되는 기법이지만, 계면활성제가 적절히 작용되지 않았거나, 단백질이 2차구조(알파나선, 베타병풍)를 가지거나, 단백질이 PTM 등을 거쳐 다른 구조를 가지는 등의 이유로 완전한 선형 단백질이 아닐 수 있습니다. 이러한 경우, 선형 단백질 모양을 상정하고 만들어진 마커와 샘플 단백질 간의 약간의 속도 차이가 발생할 수 있습니다.

 

3) 세 번째로 단백질의 pH로 인해 이러한 차이가 발생할 수 있다고 사료하였습니다. SDS용액이 충분하지 않아서 단백질 고유 전하가 모두 사라지지 않고 남아있는 경우, 양전하를 띠는 단백질은 음전하를 띠는 단백질보다 더 천천히 이동하여 젤의 위쪽에 위치할 것입니다.

 

 

6. reference

 

• https://terms.naver.com/entry.naver?docId=5751523&cid=61233&categoryId=61233 분자세포생물학백과, 네 4/4 이티브 페이지
• https://terms.naver.com/entry.naver?docId=3574008&cid=58949&categoryId=58983 화학산책, 아크릴 아마이드
• https://terms.naver.com/entry.naver?docId=5751214&cid=61233&categoryId=61233 분자세포생물학백과, 젤 전기영동
• https://terms.naver.com/entry.naver?docId=370044&cid=50317&categoryId=50317 영양학 사전, SDS
• https://terms.naver.com/entry.naver?docId=5663113&cid=62802&categoryId=62802 화학백과, 계면활성제