일반생물학 및 실험(2) 니켈-nitrilotriacetic acid agarose를 이용한 affinity chromatography 단백질 분리 정제 실험 보고서

1. 실험제목 날짜

 

본 실험 보고서는 2023년 11월 9일 진행된 일반생물학 실험, 니켈-nitrilotriacetic acid agarose를 이용한 affinity chromatography 단백질 분리 정제 실험에 대한 내용을 담고 있습니다.

 

 

2. 실험목적

 

본 실험의 목적은 affinity chromatogrphy 원리를 이해하고 이를 이용한 Ni-NTA agarose 수지를 이용하여 단백질을 직접 분리 및 정제 해보는 것입니다.

 

 

3. 실험결과

 

 

-예비 실험보고서 상에는 bradford assay로 단백질 양을 확인하도록 되어 있지만, 본 실험에서는 SDS-PAGE 를 사용하여 단백질의 양을 확인하였습니다.

 

-실험은 1, 2, 3 조가 동일한 실험을 각각 진행하였는데, 실험결과가 비슷하여 어느 한 조의 결과를 가지고 분석하여 보고서를 작성하였습니다.

 

-실험결과 사진의 가장 왼쪽은 ladder로 단백질의 양을 측정하는 눈금의 역할을 하며, 이는 전기영동 젤의 제조사에서 제공합니다. 시간, 전압에 따라 단백질의 이동량을 달라지기 때문에 빨간색 단백질을 첨가하여 헷갈림을 방지하였습니다.

 

-왼쪽에서 두 번째 well은 flow though라고 하여 컬럼 상에서 레진과 결합하지 않고 흘러나간 단백질들입니다. flow though 결과, 거의 모든 크기의 단백질들이 흘러나간 것이 확인되었으며, 심지어 타겟한 단백질과 질량이 똑같은, 즉, 타겟한 단백질의 일부도 흘러나간 것으로 사료되었습니다.

 

-flow though가 담긴 well 오른쪽으로 washing buffer를 5번 사용하여 레진에서 단백질을 분리한 용액을 각각 순서대로 전기영동하였습니다.

 

-첫번째 elusion 용액에서, 타겟 단백질이 검출되지 않았습니다.

 

-두 번째 elusion 용액에서, 타겟 단백질이 젤 상에서 가장 선명하게 나타났고, 가장 많은 단백질이 검출되었다고 판단하였습니다.

 

-세번째 elusion 용액에서, 두 번째 용액 만큼이나 선명하게 단백질이 확인되었습니다.

 

-네번째 elusion 용액에서, 옅은 단백질 선이 확인되었고, 이를 통해 미량의 단백질이 정제되었다고 판단하였습니다.

 

-다섯번째 elusion 용액에서, 어떠한 단백질도 확인되지 않았습니다. 가장 합리적인 설명은 “타겟한 모든 단백질이 이전 elusion 용액에 의해 흘러나가서 다섯 번째 elusion용액에는 단백질이 남아있지 않기 때문“이라고 사료하였습니다.

 

-두번째와 세 번째 elusion용액의 전기영동 결과, 타겟한 단백질 외에 다른 질량을 가진 선이 나타났는데, 이는 실험과정에서 컴럼의 뚜껑을 여닫거나, 위쪽 입구를 두드리는 과정에서 단백질 용액이 튀어서 들어갔을 가능성을 생각해 보았습니다. 해당 선이 타겟한 단백질의 선보다 위쪽에 위치해 있는 것은 타겟단백질 보다 질량이 크다는 것을 의미합니다. 해당 불순물이 단백질이 아닌 손에 묻어있는 불순물이나, 공기중에 떠다니는 먼지나 입자일 가능성에 대하여도 사료해 보았습니다.

 

-첫번째 elusion 용액에는 아무런 단백질도 확인되지 않았습니다. 이는 타겟 단백질이 컬럼을 빠져 나가는데 시간이 걸리고, 그 시간 동안 흘러나온 용액에는 단백질이 존재하지 않기 때문입니다.

 

-본 실험은 5번의 elusion 용액을 각각 200마이크로리터씩 흘려 줄 것을 지시하고 있습니다. 첫 번째 elusion용액, 200마이크로리터를 흘려보낸 후, 두 번째 용액을 흘려내렸을 때 가장 많은 단백질이 분리된 것을 미루어 짐작해 보면 본 실험은 전기영동의 첫 번째 well에서 아무것도 검출되지 않도록 실험적 설계가 되어있다고 사료하였습니다.

 

-따라서 타겟한 단백질을 두 번째, 세 번째 elusion 용액에서 충분히 추출된 것을 확인할 수 있었고 만족스러운 실험결과를 얻었다고 생각하였습니다.

 

4. Discussion

 

chromatography

 

-크로마토그래피는 혼합된 물질을 분리, 정제하기 위한 방법 중 하나입니다. -크로마토그래피는 각각 이동상과 고정상의 역할을 하는 물질이 있습니다. 고정상을 이동상이 통과하면서 물질의 여러 가지 특성에 의해서 이동상과 고정상의 인력차이가 발생하고 이는 속도차이로 나타나게 되어 물질이 분리되게 됩니다.

-분리된 물질을 더욱 자세히 확인하기 위해 전기영동이나 SDS page 등을 사용하기도 합니다.

 

-본 실험에서는 이동상으로 단백질이 녹아있는 용액이 사용되었고, 고정상으로는 Ni2+ NTA agarose resin 을 column에 넣어서 사용하였습니다.

 

 

크로마토그래피의 종류

 

1. 젤-filtration chromatography

 

상기 크로마토그래피는 단백질의 부피 성질에 따라 물질을 분리하는 방법입니다. column속에 구슬들이 들어 있는데 이 구슬들 내부에 작은 구멍이 뚫려 있습니다. 이동상 물체, 즉 혼합된 단백질 용액을 흘려보내면, 부피가 작은 단백질들은 구슬내부로 들어가 더 느리게 나가고, 부피가 상대적으로 큰 단백질들은 구슬 바깥의 넓은 공간으로만 흘러내려 더 빨리 column을 통과합니다. 따라서 컬럼의 아래쪽에서 위쪽 방향으로 부피가 큰 단백질부터 작은 단백질을 순서대로 구할 수 있습니다.

 

2. 이온-교환 크로마토크래피

 

상기 방식은 물질의 전하를 이용한 방법입니다. column내에 양전하 또는 음전하를 띠는 물질을 넣고 분리하고자 하는 이동상의 혼합물을 흘러내리면 같은 전하를 띠는 물질은 반발력이 작용하여 더 빨리 내려가며, 고정상과 서로 다른 전하를 띠는 물질들은 인력이 작용하여 더 느리게 내려가게 됩니다. 이러한 원리로 인해 서로 다른 전하를 띠는 단백질들을 분리할 수 있습니다.

 

3. 친화성 크로마토그래피

 

상기 크로마토그래피는 물질간의 affinity, 즉, 물질이 서로 잘 결합하는 성질을 이용한 분리, 정제 방법입니다. 고정상과 친화성이 높은 이동상이 물질은 천천히 column을 통과할 것이며, 친화성이 적은 단백질이나 불순물은 column을 더 빨리 통과하게 될 것입니다. 친화성 크로마토그래피를 단백질에 사용하는 경우, 특정 단백질에 특이적으로 결합하는 리간드를 사용하면 더욱 선택적으로 단백질을 정제해 낼 수 있습니다. 본 보고서에서 다루는 실험에서 단백질을 분리 정제하기 위해 사용된 원리입니다. 본 실험에서 사용된 기법과 같은 금속이온과의 친화성을 이용한 크로마토그래피 방법을 금속 친화성 크로마토그래피(Immobilized Metal Affinity Chromatography; IMAC) 라고 합니다. 주로 사용되는 금속 이온으로는 니켈, 코발트, 아연 등이 있습니다.

 

His-tag

 

폴리히스티딘 태그, 또는 히스-태그라고 하며, 6개의 히스티딘 잔기를 표적 단백질에 붙이는 방법입니다. 이렇게 히스-태그가 붙은 단백질은 2가 금속이온에 대한 높은 친화도를 가지게 되어 더욱 affinity chromatography를 사용하여 분리 및 정제해낼 수 있습니다. 본 실험에서는 금속이온으로 니켈을 사용하였습니다. 니켈이온을 nitrilotriacetic 산에 결합시킨 후 이를 resin에 다시 결합하여 친화 크로마토그래피 컬럼을 만들어 고정상으로 사용하였습니다. 6개의 histidine 잔기를 중 2개가 니켈이온과 강하게 결합하게 되는데 약 250mM의 농도의 이미다졸 용액으로 elusion이 가능합니다. His-tag 유전자를 대장균 유전자에 삽입하는 기법은 대장균이 his-tag가 달린 단백질을 합성하게 하여 분리, 정제가 용이해 실험기법으로 사용됩니다.

 

washing buffer, elution buffer

 

washing buffer와 elution buffer의 가장 큰 차이는 이미다졸 농도에 있습니다. 농도가 상대적으로 낮은 washing buffer를 먼저 column을 통해 흘러내리는데 이를 통해 타겟 단백질을 레진에 결합된 상태를 유지하고, 불순물이나 레진에 적절히 결합되지 못한 물질들을 제거할 수 있습니다. 이후 이미다졸 농도가 높은 elution buffer를 사용하여 타겟단백질을 레진의 금속이온으로부터 분리, 정제합니다.

 

5. furthur study

 

Q. expression Cell의 종류에 대하여 조사하시오

 

A. expression cell 보다는 expression system 이라는 용어가 더 널리 사용됩니다. 이러한 익스프레션 시스템은 타겟 단백질을 발현하는 유전자를 넣어서 단백질을 합성해 분리해내는데 사용됩니다. 이러한 expression system은 크게 두가지로 구분됩니다.

 

• 원핵생물 expression system: 주로 E. coli를 사용하며 원핵세포를 사용하여 조작이 간단한 장점이 있습니다.

 

• 진핵생물 expression system: 주로 효모(Sccharomyces cerevisiae)를 사용하며 원핵생물보다 유전적 조작은 어렵지만 원핵생물에서는 일어나지 않는 post transcriptional modification 또는 post translational modification이 일어나 사람에게 적용되는 약물 등을 연구할 때 유용하게 사용됩니다. 진핵생물은 원핵생물에는 없는 인트론 부위가 유전자에 포함되어 있습니다. 항체 단백질 등 전사 후 조절, 번역 후 조절이 있어야 인체 내에서 활성을 가지는 물질을 대량으로 합성하기 위해 동물에게 특정 유전자를 주입한 후 해당 동물의 젖을 모아서 의약품으로 활용할 수 있습니다. 이러한 동물을 pharm-animal 이라고 합니다.

 

• Human cell expression system: 사람의 세포, 특히 암세포를 분리 정제하여 연구목적으로 배양 및 활용이 가능합니다. 대표적인 예로는 Hela 세포 또는 줄기세포가 있습니다.

 

 

Q. 본 실험에서 타겟 단백질의 발현량(농도, 순도 등)을 증가시키기 위한 방법에 대하여 서술하시오

 

A. 타겟 단백질을 더욱 많이, 고농도로 정제, 추출하기 위한 몇가지 유의할 점을 생각해 보았습니다.

 

1) 혼합된 단백질 용액의 단백질 농도를 더 짙게 하여 실험에 사용합니다.

 

2) Ni++-NTA 아가로스 젤 레진의 농도를 더 높입니다. 이렇게 하면 단백질 용액이 column을 통과하는 속도가 더욱 감소하지만 더 많은 양의 단백질을 추출할 수 있습니다.

 

3)washing buffer의 이미다졸의 농도를 더 높여서 실험에 사용하면, 혹여 금속이온에 붙어 레진에 남아있는 단백질을 최소화할 수 있습니다.

 

4) 본 실험의 예비보고서 상에는 대장균에서부터 합성되어 추출된 단백질을 다루고 있습니다. 추출하고자 하는 단백질을 더 많이 합성, 발현 시킬 수 있는 생물을 세포주로 사용하면 더욱 많은 단백질을 얻을 수 있습니다.

 

 

 

Q. Histidine외 fusion protein으로 무엇을 사용할 수 있는지 서술하시오

 

A. Fusion protein은 도메인, 즉 펩타이드가 서로 다른 단백질이 연결되어 있는 형태입니다. 실험적인 목적을 위해 Fusion protein이 실험실에서 여러 종류의 fusion protein이 합성되어 이용됩니다.

 

1) GFP:녹색 형광단백질이라고 하며, 타겟 단백질과 fusion하여 타겟 단백질의 발현양, 위치 등을 파악할 수 있습니다.

 

2) GST: 클루타치온 S-전이효소라고 하며 히스티딘과 마찬가지로 tag로 사용되어 단백질을 정제할 수 있습니다.

 

3) MBP: 말토오스와 fusion된 단백질로 tag로 사용되어 단백질 정제와 protein-portein interaction 연구에 사용됩니다.

 

4) Flag-tagged fusion protein: 바이러스에서 추출한 합성 peptide로 만든 단백질 tag입니다.

 

5) Myc-tagged fusion protein: 믹 tag는 c-Myc를 재료로 만든 태그로 단백질 태그로 사용됩니다.

 

 

 

Q. 타겟한 단백질이 정확히 분리, 정제되었는지 알수 있는 방법에 대하여 서술하시오

 

A.

 

-타겟 단백질의 질량을 알고 있다면, 전기영동을 통해 분리한 후, ladder와 비교해봐서 알고있는 질량과 같으면 적절히 분리된 것을 확인할 수 있습니다. 이때 SDS page를 사용하여 단백질 고유의 전하를 모두 없애 주어서 오로지 질량만으로 분리가 되도록 합니다.

 

-웨스턴 블랏: SDS-PAGE를 실시한 다음 웨스턴 블랏을 실시하기도 합니다. western blot 방법은 타겟 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하는 방법입니다.

 

-만일, 타겟 단백질의 정확한 양을 알고 있다면 bradford assay, BCA assay, Lowry assay등을 사용하여 정확한 양을 측정하여 잘 정제되었는가를 알 수 있습니다

 

 

6. reference

• https://terms.naver.com/entry.naver?docId=5568830&cid=61233&categoryId=61233 분자.생물학 백과, 크로마토그래피
• https://terms.naver.com/entry.naver?docId=5733540&cid=60266&categoryId=60266 생화학백과, 히스 꼬리표
• https://terms.naver.com/entry.naver?docId=5141732&cid=60266&categoryId=60266 생화학백과, 친화성 크로마토그래피
• https://terms.naver.com/entry.naver?docId=5647088&cid=62861&categoryId=62861 식물학백과, 녹색형광단백질
• https://terms.naver.com/entry.naver?docId=5569289&cid=61233&categoryId=61233 분자 새포생물학백과, western blot
• https://terms.naver.com/entry.naver?docId=5751220&cid=61233&categoryId=61233 분자 세포생물학백과, 분광검사법
• https://komabiotech.co.kr/pro/view?cadSeq=1244 단백질 정제용 레진 종류