일반생물학 및 실험(2) - 플라스미드 DNA 분리 (미니프랩) 실험 보고서

1. 실험제목 날짜

 

본 실험보고서는 2023년 10월 05일 진행된 4주차 일반생물학(2) 플라스미드 DNA 분리(미니프랩) 실험에 관하여 작성한 실험보고서입니다.

 

2. 실험목적

 

이 실험은 세균의 전제 DNA 중에서 genomic DNA를 빼고 플라스미드 DNA 만을 선별, 분리 및 정제하기 위한 기법인 미니프랩을 직접 수행하고 관찰하여 본 기법의 원리를 이해하고 절차를 숙지하는 것을 목적으로 두고 있습니다.

 

3. 실험결과 간단설명

전기영동 결과, 약 5.5kb(5만5천 베이스페어)로 이루어진 DNA 띠가 식별되었습니다. 이는 플라스미드 DNA sample의 질량과 같습니다. 상기 띠 외의 다른 띠는 관찰되지 않았으며 이를 통해 다른 세포 구성 물질들은 모두 걸러지고 타겟한 플라스미드 DNA만이 정제된 것을 알 수 있었습니다.

 

4. Discussion

 

solution 1: 포도당, Tris-Cl, EDTA 함유

 

• 포도당은 대장균이 담긴 용액을 고장액 환경으로 만들어 삼투현상에 의해 대장균 내의 물이 대장균 몸 밖으로 빠져나가도록 합니다. Tris-Cl은 강 염기로 pH를 8로 유지시킵니다. 마지막으로, EDTA는 세포벽을 약하게 만들어 쉽게 파괴되도록 만들며, 또한 DNase 효소의 기능을 저하시켜 DNA를 보호하는 역할을 합니다.

 

solution 2: NaOH, 1% SDS 용액

 

• SDS 용액은 강한 음전하를 가지기 때문에 용액을 염기환경으로 만듭니다. 이때, 염기환경에 노출된 세포는 쉽게 파괴됩니다. 또한 SDS는 단백질이나 DNA에 결합하여 소수성 부분을 노출시켜 물에 녹일 수 있습니다.

 

solution 3: 아세트산, 아세트산 칼륨, 물

 

• 아세트산과 아세트산 칼륨은 산성을 띠는 용액으로 변성된 DNA를 응집시켜 복구할 수 있습니다. 이때, 선형 DNA는 응집이 될 때 꼬여버려서 완전한 annealing이 불가능하지만, 원형 플라스미드는 복구가 가능합니다. 아세트산 칼륨과 SDS가 섞이게 되면 침전되어 원심분리를 통해 정제해 낼수 있습니다.

 

-상기 용액을 순서대로 투입하여 실험을 수행하였습니다.

 

-solution 2 용액을 취급할 때, 과도하게 흔들게 되면 chromsomal DNA와 plasmid DNA가 섞여버리게 됩니다. 따라서 solution 2 용액 취급시 흔들리지 않도록 주의를 요하여 실험을 수행하였습니다.

 

5. 실험원리

 

미니프랩

 

세균 내의 다른 단백질 및 genomic DNA를 걸러내고 플라스미드 DNA 만을 추출해내는 기법입니다. 본 실험에서는 SDS를 이용한 염기 lysis를 수행하였습니다.

 

SDS

 

SDS 는 sodium dodecly sulfate의 약자로 강한 음전하를 띠는 친수성 부분과 소수성 부분의 탄화수소 꼬리로 이루어져 있어 계면활성제의 역할을 합니다. basic 용액과 SDS는 세균의 cell wall과 cell membrane을 부수고 내부의 DNA와 단백질에 달라붙습니다. SDS의 소수성 부분이 단백질과 핵산의 소수성 부분과 결합하고 SDS의 친수성 부분이 물과 결합하여 세균의 물질들이 물에 잘 녹도록 만듭니다. 이때, 이때 아세트산 칼륨을 사용하여 용액을 중성으로 만들면 세균의 물질들이 침전되어 centrifugation을 통해 추출해 낼 수 있습니다. 이때, 원형 플라스미드 DNA는 슈퍼코일의 형태이기 때문에 중성환경에서 형태를 쉽게 복구하므로 따로 분리해 낼 수 있습니다.

 

6. furthur study

 

예비 실험보고서에 질문이 없습니다.

 

7. reference

 

• Campbell biology, 12th global edition, San Francisco: Pearson Benjamin 2021
• 네이버 지식백과 https://terms.naver.com/entry.naver?docId=5141572&cid=60266&categoryId=60266 DNA vector 5/5
• https://terms.naver.com/entry.naver?docId=5894586&cid=61232&categoryId=61232 DNA 추출